一、cDNA的结构？
cDNA为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构。
二、cdna文库的来源？
cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
三、cdna文库原理？
1. cdna文库是一种用于基因表达研究的工具，可以将细胞或组织中的mRNA转录成cDNA，然后将其克隆到载体中，构建成文库。2. cdna文库的原理是利用反转录酶将mRNA转录成cDNA，然后利用DNA聚合酶将cDNA扩增，再将其克隆到载体中，构建成文库。这样就可以得到一个包含细胞或组织中所有基因表达信息的文库。3. cdna文库的应用非常广泛，可以用于基因克隆、基因表达分析、蛋白质互作研究等领域。同时，随着高通量测序技术的发展，cdna文库也成为了RNA测序的重要工具之一。
四、cdna测序流程？
测序的流程如下。首先在dna的两端加上adapter。随后进行建库。建库之后用测序仪对index进行检测，从而得到cdna中序列信息。
五、cdna的浓度如何测定？
需要使用仪器测试其OD值,对照标准浓度即可算出其浓度。
六、cdna和mrna的区别？
在于cdna是经过反转录过程合成的DNA，而mrna是由DNA转录过程中合成的RNA。具体原因是因为在RNA转录时，mrna是首先合成的，随即进行翻译形成蛋白质；而cdna的合成是基于已有的mrna模板，经过反转录过程将其转录成相应的DNA序列。因此，相较于mrna的合成过程，cdna的合成过程涉及到反转录的环节，所以二者在结构和功能上有所不同。可以介绍二者在实验室应用中的区别，在某些研究中，利用反转录方法可以大量制备cdna，从而更好地研究基因表达谱或者对某些原始样本的基因进行研究。而mrna则可以用来评估基因表达量，研究基因的转录和调控机制等。
七、cdna的浓度和纯度？
rtpcr时提取rna的浓度和纯度要求：浓度20ng/ul以上足够了，如果用的是组织提取，浓度一般很高，可以达到几百甚至几千。如果你用的是病毒、少量细胞，浓度低一些也没有关系。
纯度需要用仪器测一下。260/280理论值应该有2.0以上，260/230值1.2以上基本合格。
RT-PCR：最重要的是RNA是否有明显降解，这个需要跑电泳看。一般来说28S应该比18S亮1.5-2.0倍，说明提取得不错。
反转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）是将RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达
八、rna合成cdna的流程？
制备互补DNA，往往需要先分离从目的基因转录来的mRNA.如果该基因编码的蛋白质是细胞中的主要蛋白质，则此基因的产物是总mRNA的主要组成部分。就胰岛B细胞而论，此细胞含有高水平胰岛素前体mRNA，后者有时可以沉淀正在翻译的mRNA的核糖核蛋白体，如果用特异抗体结合所表达的蛋白质(抗原)，则可从沉淀的核糖体中分离出胰岛素特异的mRNA，一般特异mRNA只是细胞总mRNA中的次要成分。
在这种情况下，不得不以密度梯度离心，按分子量大小把总mRNA分开，然后把分离开的mRNA直接用于试管中表达蛋白质(用家兔网织细胞的溶胞产物或小麦胚芽提取物作为翻译系统的诱导物)再用免疫沉淀或聚丙烯酰胺凝胶电泳从许多表达的蛋白中测定出目的蛋白，从而确定表达该蛋白的特异mRNA。合成步骤
1．cDNA第一链的合成 所有合成cDNA第一链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒（MLV）反转录酶。AMV反转录酶包括2个具有若干种酶活性的多肽亚基，这些活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA-RNA杂交体的RNA部分进行内切降解（RNA酶H活性）。
MLV反转录酶只有单个多肽亚基，兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA杂交体中的RNA的能力较弱。且其热稳定性较AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的eDNA（如大于2～3kb）。AMV反转录酶和MI。V反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH、最适盐浓度和最适温度各不相同．所以合成第一链时相应调整条件是非常重要的。
AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3’端poly（A）结合的12～18个核苷酸长的oligo（dT）。
2．cDNA第二链的合成 cDNA第二链的合成方法有以下几种：
（1）自身引导法。合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物。当第一链合成反应产物的DNA—RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成eDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5’端序列出现缺失和重排，因而该方法很少使用。
cDNA合成
（2）置换合成法。该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的DNA RNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下。利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物。在大肠杆菌DNA聚合酶工的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点：①非常有效；②直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；③不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。
3．cDNA合成技术 以Riboclone M-MLV CDNA合成技术为例。
Riboclone M—MLV cDNA合成系统采用M—MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶，使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶，cDNA第二链合成采用置换合成法，采用RNaseH和DNA聚合酶I进行置换合成，最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端，方法简便易行。其基本步骤为先合成第一链：
（1）取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和适当引物，每RNA使用0.5ug引物（如使用Not I引物接头，用0.3ug），用HO调整体积至15ul，70℃处理5min冷却至室温，离心使溶液集中在管底，再依次加入：
5X第一链缓冲液5ul。
RNasinRNA酶抑制剂25U
M—MLV（H）反转录酶200U
H2O调至总体积25ul
（2）用手指轻弹管壁，吸取5ul至另一eppendorf管，加入2~5ulCi[α一P]dCTPdCTP（>400Ci/mmol），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
（3）37℃（随机引物）或42℃（其他引物）保温1h。
（4）取出置于冰上。
（5）掺入测定的eppendorf管加入95ul 50mM EDTA终止反应，并使总体积为100ul。可取90ul进行电泳分析（先用苯酚抽提）。另l0ul进行同位素掺入放射性活性测定。
（6）第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成。
以上25ul反应总体积中所用RNA量为1ug，如合成5ugRNA，则可按比例扩大反应体积。倒5ugRNA使用125uL总体积进行合成。
第一链合成后再进行第二链合成：
（1）取第一链反应液20uL，再依次加入：
10X第二链缓冲液20uL
DNA聚合酶123ul。
RNaseH0.8ul
H2O加至终体积为100/uL
（2）轻轻混匀，如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定，可取出10uL至另一eppendorf管，加入2～5uLCi[α一P]dCTP。
（3）14℃温浴2h（如需合成长于3kb的cDNA，则需延长至3～4h）。
（4）掺入测定eppendorf管中加入90ul 50mM EDTA，取10ul进行同位素掺入放射性测定．余下的可进行电泳分析。
（5）将cDNA第二链合成的反应液70℃处理10min，低速离心后置于冰上。
（6）加入2uL T4 DNA聚合酶，37℃温育10min。
（7）加入10uL 200mmol/L EDTA终止反应。
（8）用等体积苯酚：氯仿抽提cDNA反应液，离心2min。
（9）水相移至另一eppendorf管，加入0.5倍体积的7.5mol/l醋酸铵（或0.1倍体积的1.5mol/L醋酸钠，pH5.2），混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇（一20℃），一20℃放置30min后离心5min。
（10）小心丢去上清液，加入0.5mL冰冷的70%乙醇，离心2min。
（11）小心移去上清液，干燥沉淀。
（12）沉淀溶于10～20ul TE缓冲液。
九、pcr的cdna的合适浓度？
qpcr对cdna浓度要求
qpcr在逆转成cdna时，会残留一些物质对qpcr有严重的抑制作用,造成ct偏大、扩增效率偏大。 cdna上样量不要超过反应体积的1/10
十、cdna反转录步骤？
cDNA反转录是一种将RNA转录为cDNA的技术，其步骤如下：
1. RNA提取：从细胞、组织或液体中提取RNA样品。
2. 反转录反应体系：将RNA样品与逆转录酶、随机引物（或Oligo（dT）引物）、dNTPs等反转录试剂混合。
3. 反转录反应：将反转录反应体系进行加热反应，通常反应温度为42-50℃，反应时间为30-60分钟。
4. 酶反应终止：将反应体系加热至95-98℃，用高温不可逆地使逆转录酶失活，终止反应。
5. 储存cDNA：将反转录反应产生的cDNA样品进行储存，以备后续实验使用。
需要注意的是，在反转录过程中应该控制好反转录的条件，例如反转录温度、反应时间、反转录试剂的质量等，以获得高质量的cDNA。